嵌合抗原受体(CAR)T细胞已是肿瘤免疫治疗领域典型的范例，已成为肿瘤治疗历史上里程碑式的成就。年，FDA批准了两款针对CD-19的CAR-T细胞治疗，两款CAR-T在B淋巴细胞瘤上有着显著地疗效。目前，多种CAR-T设计正在进行恶性血液病，乃至实体瘤免疫治疗的研究。为了在体外产生CAR-T细胞，慢病*载体（LVs）由于其可以稳定的将大片段DNA有效的整合进分裂和非分裂细胞而被广泛应用。本文将综述生产CAR-T细胞的最新进展和挑战，以及用于制备GMP级别CAR-T的LVs的生产过程，概述CAR-T治疗的应用进展，特别强调下一代同种异体CAR-T细胞。
介绍近些年来癌症免疫治疗已经革命性的改变了肿瘤治疗手段，逐渐成为一种有效的低侵袭性的治疗策略，广泛的应用于多种肿瘤的治疗。多种策略正在研究用于癌症免疫治疗，包括过继性细胞治疗，细胞因子，单克隆抗体（mAbS）,以及肿瘤疫苗（图1）。在这些靶向肿瘤免疫治疗中。免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗具有令人振奋的响应率，在肿瘤免疫治疗领域取得了空前的成功，尤其是对那些其他方法治疗失败的患者来说，免疫治疗重新为他们的燃起了治疗希望。CARs是基因工程化的T细胞受体（TCRs）,通常由胞外结构域和胞内结构域组成。其中胞外结构域包含一条源自单克隆抗体的单链可变区结构域（scFv）,可以结合肿瘤细胞表面抗原。胞内结构域包含4-1BB(CD)和/或CD28共刺激因子（为T细胞扩增和持久性提供第二信号），胞内结构域还包含TCRCD3ε链（为T细胞激活提供第一信号）。这些修饰的的TCRs设计使T细胞重定向，靶向癌症细胞特异性表面抗原。不同于自然地TCRs,CARs不依赖于主要组织相容性复合物（MHC）,其主要作用类似于抗体检测细胞表面蛋白，糖磷脂，碳水化合物的表达。换句话来说CAR-T细胞的主要思想是将抗体特异性与抗原的结合的特性和T细胞胞内精确地细胞信号传导以及细胞杀伤作用有机的结合了起来（图2）。
图1.肿瘤免疫治疗方法
在CAR-T细胞治疗中，从病人自身分离到的T细胞，（无论是CD4+T细胞，还是CD8+T细胞，）通过基因工程化修饰，选择性的攻击肿瘤细胞。然而，CD8+CAR-T(而不是CD4+CAR-T)用于治疗容易导致T细胞耗竭，凋亡，有效性较差。另一种策略是通过鉴定分离肿瘤患者肿瘤组织中浸润性T淋巴细胞和外周血中的淋巴细胞，通过在体外选择，扩增，分化成为有效应功能，可增殖的肿瘤杀伤细胞。完全的阐述工程化TCRs在肿瘤免疫治疗中的应用超出了本文的内容范畴，但是其临床治疗效果有待商榷。两款已应用于临床治疗的CAR-T相比（KymriahTM(Novartis,Basel,Switzerland)andYescartaTM(KitePharma/GileadSciences,FosterCity），两款CD19CARs都有着显著地抗血液肿瘤疗效，尤其是在难治的复发性B细胞急性淋巴性白血病治疗，以及难治性，复发大B细胞淋巴瘤治疗中，病人病情得到持续性缓解。KymriahTM主要用于小儿和年轻患者复发性难治性前B细胞急性淋巴性白血病，YescartaTM主要用于成年患者的B细胞霍奇金淋巴瘤。
病*和非病*载体都可用于CAR-T细胞生产。在病*载体中，慢病*载体（LVs）由于其有效的将基因整合进靶细胞基因组，稳定的基因表达等特点，被认为是最有希望的基因治疗载体。图3阐述了基于慢病*载体LV的CAR-T细胞制备的主要步骤。与其他病*载体相比，慢病*载体的整合模式具有更低的致癌风险，以及随机整合基因风险低，因此，用慢病*载体生产CAR-T细胞更加安全有效，而且灵活。更重要的是慢病*相较于其他病*载体，生产成本相对较低。另外，慢病*载体可以转导分化细胞，也可以转导分化细胞，因此，慢病*载体可以转导更为广泛的细胞，包括那些难转导的血液前体细胞，神经细胞，淋巴细胞和巨噬细胞。
本文主要描述目前已有的CAR-T类型和应用，以及以LV为载体的GMP级别的CAR-T生产。根据已发表文献，专利，临床治疗CAR-T,讨论基于LV的CAR-T生产策略。
图2.TCR与CARs的不同
CAR-T细胞类型CAR-T细胞产生
近年来，多种CAR免疫治疗策略正在改善着CAR-T治疗的有效性和安全性。在第一代CAR分子中，胞外域包含scFv结合于肿瘤相关抗原TAA,胞内结构域包含CD3ε信号结构域或Fcγ受体。在该结构中，CAR-T激活第一信号由scFv结合TAA提供，CD3ε提供了T细胞激活的胞内信号，第2信号。第二代CAR-T中，实现了T细胞一步激活，CAR分子的胞内部分和CD3ε，共刺激分子CD28或4-1BB胞内信号结构域结合，信号1和信号2都由scFv与TAA的结合诱导刺激产生。尽管在小鼠抗肿瘤模型上CD28和4-1BB具有类似的活性，但是CD28CAR-T表现出了更多的增殖，而4-1BBCAR-T显示有更持久的活性。第三代CARs在胞内信号结构域加上了第二个共刺激分子。因此，scFv结合TAA后激活了CD3ε第一信号和以两个共刺激分子信号为通路的第二信号。CD28结合4-1BB或CD28结合OX40作为共刺激分子在第三代的CAR-T中最为常见。截至目前，少许第三代CAR-T已经进入临床试验，其相对于2代CAR-T的优越性还需要进一步评估。理论上，只要TAA在癌细胞表面表达，CAR-T就可以识别。然而由于实体瘤表型的异质性，一些癌细胞不能被CAR-T识别，这就大大降低了CAR-T治疗的几率。第四代CAR-T,被认为是T细胞重定向，普遍的细胞因子杀伤型CAR-T细胞（TRUCKs），用于解决由于癌细胞表型异质性带来的杀伤作用降低等问题。在该策略中，CAR-T被修饰成当CAR-T被激活时，诱导表达细胞因子如IL-12(如NF-AT(激活的T细胞核因子)控制的表达)。因此，IL-12在肿瘤细胞周围积累，引起固有免疫反应杀伤肿瘤。图4A举例说明了4代CAR-T。
图3.应用慢病*载体生产CAR-T的流程
CAR-T细胞的进一步发展针对特定TCR位置--TCRα恒定区的CARs(TRAC)
通常，基因编辑的CAR是通过病*载体或其他载体随机整合进T细胞基因组，在这个过程中，造成了一些广谱且不适宜的整合，包括克隆增殖，基因沉默，差异性表达，以及一些有可能致癌的转化。最近，(CRISPR)/Cas9技术已经用于CD19-CAR的构建，精确地将CAR整合进TRAC区域，这一改进，较常规的CAR-T相比，TRACCAR-T提高了CAR-T的性能(图4B)。
通用的的CARs和CAR-T细胞
由于每种CAR只识别一种，最多两种靶分子的限制，有人尝试开发CAR分子可以识别任何抗原，例如将scFv替换为Avidin(生物素结合免疫受体BBIRCAR),该CAR可以结合任何生物素化的抗体。最近，还有另一种策略叫做SUPRACAR(分离的，普遍，可编程)，该策略由一个普遍的受体伴随亮氨酸拉链适配子（zip-CAR），以及一个单独的scFv伴随拉链适配器(zip-scFv)构成。该系统的优点是抗原特异性可以通过改变scFv而改变，但不影响CAR-T细胞（图4C）
目前，获准的CAR-T系统为自身CAR-T细胞。由于其昂贵的成本和时间消耗，限制了该CAR-T的治疗可行性。因为很多患者在先前的治疗中经历了化疗，淋巴细胞数目大量减少。因此，通用的CAR-T细胞治疗更有优势。更加理想的策略是通过基因工程手段消除内源性的TCR和或HLAI,以免同种异体的CAR-T引起移植免疫排斥反应。
自驱使的CARs
为了便于T细胞追踪肿瘤细胞，一些研究者在CAR-T细胞上共表达趋化因子受体，以达到与表达趋化因子的肿瘤细胞以及肿瘤相关细胞结合。例如Craddock和他的同事借助于共表达CCR2b趋化因子受体，使anti-GD2CAR-T细胞向分泌CCL2的神经母细胞瘤细胞归巢率提升了近10倍。类似的，在CD30-CAR-T细胞上共表达CCR4,显著提升了CD30-CAR-T向CCL-17阳性霍奇金淋巴瘤细胞的移动。（图4D）
武装化的CARs
通过基因工程手段修饰抵抗免疫抑制，提升治疗效果的CAR-T,称作为抗免疫抑制的CAR-T细胞或者称作武装化的CAR-T。为此，免疫抑制因子的显性阴性受体(如转化生长因子-β[TGF-β])通常与相应的CAR共同表达，以增强CAR-T细胞的疗效，尤其是实体瘤。另一种策略是开发免疫检查点疗法，招募免疫检查点抑制剂到那些广泛表达关键性抑制调节通路的肿瘤细胞和肿瘤基质细胞周围。进一步武装化的CAR-T细胞可以分泌细胞因子，或者表达可溶性配体（如IL-12）来增强细胞*性以及抵御肿瘤微环境的作用。
On-switchCAR
也可以称作受体分离式CAR，这些CAR-T细胞设计为初始失活型，直到通过加入诱导剂诱导才被激活，完成工程化T细胞的完整信号。他们的受体包含两个独立的受体部分，一个抗原结合受体类似于传统意义上的CARs,以及胞内信号元件，二者在有小分子存在时完成组装，可以实现时间，空间上的控制以及根据CAR-T活性，在剂量上进行调节。
Off-switchCARs也可以称作为自毁式CARs,这些细胞设计为易于清除异常细胞，包括制备进程中由于基因整合造成的的致癌转变，以及当输注的细胞*性太强时，需要封闭掉这些*性，就可以启动这些细胞的自毁装置而达到调节。该策略通常借助于一些自杀基因，例如疱疹病*的胸苷激酶，可诱导的人caspase9，Fas等来驱使工程化T细胞的凋亡。该策略的一个实例是在系统中运用cas9水解结构域连接在人FK结合蛋白上，可以实现小分子雷帕霉素类似物加入，引起的条件二聚化。TaggedCARs
标记的CAR-T细胞或杀伤开关CAR-T细胞包含一个特定的可靶向部分，该部分可被上市的单克隆抗体药物识别，并在发生不良事件时触发T细胞清除。当这些细胞的标签是肿瘤抗原时，运用单克隆抗体可介导T细胞清除，增强抗肿瘤活性。例如应用该策略的CAR-T，有表达人EGFR多肽的CAR-T，表达CD34/CD22融合抗原表位（RQR8）的CAR-T，可以分别被cetuximab和rituximab识别。如图4H
DualCARs
二联CARs,也叫做并门CARs，表达两种类型的CAR，识别两个靶点。这些CARs的胞内结域尾部不同，一个含有CD3ε信号结构域，另一个则含有共刺激结构域。二联CARs只有在两个CARs结合他们相应的抗原时，才被激活。因此，一个抗原的结合不足以诱导T细胞反应，所以，健康组织在表达一种抗原时不会被CAR-T细胞损伤。
TanCARs
串联CARs,也称作或门CARs,在该系统中，CAR-T细胞表达双特异性CAR,包含两个scFv的串联，每个scFv识别一种靶分子，例如CD19和CD20,两个靶点都是B细胞恶性瘤的表面抗原，CD19-OR-CD20CAR-T可以结合一种或两种抗原来阻止CD19-细胞的逃逸。另一个实例中用HER2/CD19双特异性CAR-T细胞显示出协同的抗肿瘤活性。
iCARs
抑制型CAR(iCAR)T细胞，或称作非门CAR-T细胞，被用于需要时，限制T细胞反应。(iCAR)T细胞表达两个独立的CARs:一个传统的激活CAR和一个抑制iCAR。T细胞的激活是通过传统的CAR与靶抗原结合实现的，而当iCAR与靶抗原结合时，CAR-T失去活性。iCAR设计保护了健康组织，免于T细胞在识别肿瘤抑制蛋白时被误伤，以及在识别那些癌细胞低表达，健康组织广泛表达的抗原时，不至于被T细胞误伤健康组织。
图4.CAR-T产生和下一代CAR-T设计
CAR-T细胞的下游信号通路CAR-T细胞胞内级联的下游信号通路影响着CAR-T细胞在体内的有效性和持久性。对CAR-T细胞的活性和持久性所涉及的分子机制的深入理解,仍然是一个开放的研究领域。在Karlsson和他的同事们的前沿工作中，对CAR-T下游信号通路的研究主要通过对下游多种蛋白激酶的磷酸化水平进行评估。他们强调,在三代和二代CAR-T细胞中，三代CAR-T有着本质上的高水平磷酸化和本质上的高信号强度。然而，在二代和三代CAR-T中，CD3ε,LAT,LCK,ZAP70,Paxillin,PECAM-1,RAS,ERK/MAPkinase1/2,EGFR,和CDK2具有类似的磷酸化水平。CD3ε,LAT,LCK,和ZAP70的激活需要TCR信号，而Paxillin和PECAM-1在大多数炎症条件下，调节T细胞粘附和白细胞跨内皮细胞的迁移。Ras的异常表达,通过抑制一氧化氮信号通路，阻止了TCR信号的级联转导，最终诱导*性颗粒的外吐（例如：穿孔素，颗粒酶A，颗粒酶B）。
PI3K信号通路也影响着CAR-T细胞的分化和持久性。该信号通路在CAR-T细胞中明显上调，通过mTOR介导的糖酵解驱使CD8+效应CAR-T细胞的分化。有趣的是，在体外扩增时，当抑制了抗原无关的构成型PI3K通路，可通过增强幼稚T细胞/干细胞样记忆T细胞和中央记忆T细胞群体,以及减少效应T细胞群体，从而改善体内T细胞的持久性和细胞因子的产生。然而，抗原依赖的PI3K信号与CAR-T的效能和CD8+T细胞介导的肿瘤消除有关，这就预示着CAR-T在体外扩增时抗原非依赖性PI3K激活与CAR-T体内持久性有关。此外，在一个CAR基因治疗模型中，利用组蛋白赖氨酸乙酰化的识别结构域bromodomain和外蛋白基序的抑制剂JQ1处理CAR-T，导致体外扩增的CAR-T具有干细胞记忆T细胞和中央记忆T细胞的表型，并延长了CAR-T在体内的持久性。BET蛋白作为c-Myc信号的调节因子，可以抑制那些与Myc依赖的靶基因下调的相关蛋白质。因此，抑制PI3K和mTOR活性可诱导c-Myc信号通路，导致CAR-T细胞代谢和分化的改变。上调c-Myc,通过调节葡萄糖和氨基酸代谢促进T细胞代谢的重编程。另外，已经证实在绝大多数实验条件下，c-Myc信号通路对T细胞增殖增长是必要的。
促炎细胞因子水平（例如IFN-γ,IL-2,IL-6）的峰值水平，通常在输注CAR-T体内激活后5天内检测。IFN-γ,IL-6在CAR-T的活性，以及后续的副反应中起着很重要的作用。大多数情况下，IL-1先于IL-6产生（大约24h）,推测IL-1信号通路可能在体内激活CAR-T细胞后,启动细胞因子的升高,图5阐明肿瘤抗原与CAR结合后CAR-T细胞活化和扩增的主要信号通路。
图5.简要描述CAR-T涉及的主要细胞信号通路慢病*生物学及慢病*载体的发展慢病*属于逆转录病*家族中的一个亚科。感染颗粒为正二十面体衣壳蛋白包裹着螺旋结构的核糖核酸蛋白，衣壳被含有病*糖蛋白的细胞脂质包膜所包围。病*粒子包含两个RNA基因组拷贝和病*复制酶。所有的逆转录病*都有gag(衣壳蛋白)、pol(逆转录酶和整合酶)和env包膜蛋白基因。另外，慢病*含有两个调节基因tat和rev，而人类免疫缺陷病*1型(HIV-1)有额外的辅助基因，包括vif、vrp、vpu、nef，它们编码参与病*复制的蛋白。病*基因组还包含两个未翻译的区域5’R-U5和3’U3-R末端。
在病*附着到宿主细胞后，病*RNA渗透进宿主细胞，并以此为模板，利用逆转录酶合成病*cDNA,在逆转录和合成双链DNA的过程中，RNA的两端都进行了复制，产生了长末端重复序列（LTRs）,在双链的病*DNA中，每条链含有U3-R-U5序列，然后双链DNA被运送到细胞核内。新合成的逆转录病*DNA整合到宿主DNA中，称为原病*。原病*在细胞周期过程中复制，然后传递给子细胞。不像其他逆转录病*科成员，慢病*可以有效地感染不分裂的细胞，这使它们更有吸引力用于基因治疗。最后，子代病*基因组从整合的DNA转录到细胞质中。病*粒子从质膜出芽获得其脂质包膜。在出芽过程中，病*蛋白被病*蛋白酶裂解，产生成熟的感染性病*粒子。
慢病*载体是最为常用的原代细胞稳定转导的基因递送系统。虽然LVs可以从其他慢病*中获得，但今天大多数LVs来自HIV-1（图6A）。出于安全性的考虑，重组LVs设计为复制缺陷型。为了达到该目的，产生病*所需要的元件被分割在几个质粒上。第一，编码感兴趣基因的转移质粒含有必要的顺式作用元件：（Ⅰ）侧翼的长末端重复序列LTR基因，是基因表达，逆转录和整合必要的，（Ⅱ）ψ序列是基因组RNA包装所需，（Ⅲ）逆转录反应原件RRE(可选择的)，促进病*RNA的加工和运输。第二，包装质粒，包含必要的反式作用元件：gag/pol编码病*复制所需的结构元件，可选择的rev用于病*RNA转录本的核输出，tat用于激活5’LTR弱启动子驱动的基因高水平表达。第3，包膜质粒，通常驱动病*糖蛋白的表达VSV-G(水泡性口炎病*的g糖蛋白)，为LV颗粒提供受体结合蛋白。这样，由于包装病*DNA所需的病*组分与转移质粒分离，包装序列无法整合到病*基因组中，LV无法复制。到目前为止，已经开发了三代LVs。图6（B-D）：
*第一代慢病*载体：慢病*辅助基因vpu,vpr,vif,nef,tat,和rev包含在该系统中。然而，存在一种风险是，产生病*的宿主细胞内内源性病*元件与重组的慢病*递送系统的病*元件可以互补产生有复制能力的慢病*。因此，由于安全性问题，这些载体没有得到广泛使用。
*第二代慢病*载体：在这个系统中，基因组元件编码的病*辅助蛋白vif,vpu,vpr,或nef被移除，因为它们与病*在原代细胞和体内的繁殖有关，但对于重组LV的生产是必不可少的。因此，第二代LV系统的包装质粒编码9个HIV基因中的4个:gag、pol、tat和rev。
*第三代慢病*载体：整合到宿主基因组的完整LTRs的存在可能存在安全风险。首先，因为在这种情况下LV转导的细胞变为被野生型病*感染的细胞，整合的载体可以被挽救，产生重组LV不需要的复制元件。此外，LTRs的整合可以激活邻近的细胞基因，并最终激活一个编码细胞增殖相关蛋白的基因。为了克服这些潜在的风险，通过引入LTR的U3区域的缺失，开发了第三代自灭活的LVs，从而导致可能被激活的包装载体的转录失活。此外，tat从转移质粒中被删除，其转录功能通过替换U3启动子区域来完成，转移质粒中5’LTR用其他强病*启动子如CMV或RSV启动子替换。最后，为了增加安全性，rev由一个单独的质粒编码。因此，该系统由四个质粒组成:(i)LTR部分缺失的转移载体和相关基因的外源启动子驱动表达;(ii)只含有gag和pol基因的包装质粒;(iii)rev质粒;(iv)包膜质粒(VSV-G)。
目前，CAR-T细胞主要通过病*载体制备，大多数情况下由慢病*或逆转录病*做载体。与γ逆转录病*载体相比，LVs因其更安全的整合位点而更常用于临床试验。一般来说，基于病*的载体比传统载体具有几个潜在的优势，包括具不同病*有不同表达特征的可用性、高转导效率、永久整合进宿主细胞基因组的能力、相对较短的转导时间，以及利用组成型生产细胞系进行大规模生产的能力。尽管有这些优点，但是基于病*的载体仍然存在着安全隐患。LV和逆转录病*载体的半随机和不受控制的整合进宿主基因组导致插入突变，产生一定程度上的工程化细胞具有癌变的潜在风险。此外，可变的拷贝数可以通过病*载体转移并在T细胞表面表达，这可能导致异质性的CAR-T细胞群,具有不同的细胞*性能力。为了克服这一局限性，重要的基础和临床研究致力于开发替代的非病*载体系统，如微圆环DNA、转座子、位点特异性编辑工具、CRISPR/Cas9技术和分子偶联。最近，CAR-T细胞已经通过转座子成功构建，包括睡美人转座子，转座因子系统。这些系统具有比病*载体更大的转基因能力。然而，由于它们随机插入的特点，仍然需要考虑其临床应用的安全性和有效性。位点特异性编辑工具如TALENs和ZFNs可以用来解决基因组特定基因座整合的问题。为了使它们在临床试验中更受欢迎，需要降低设计和优化每个目标位点的酶的成本，提高它们的效率。新兴的CRISPR/Cas9技术正在努力产生高度均质化的CAR-T细胞群。使用位点特异性编辑工具，通过特定位点的整合，产生内源性TCR被剔除的CAR替代的TRACCAR-T细胞。虽然这项技术为研究人员提供了精确制造T细胞的宝贵经验，但它的编辑效率与病*转染的编辑效率并不匹配。此外，利用CRISPR/Cas9进行相对较大的转基因转移仍然是一个挑战。考虑到所有这些要点，非病*载体有一些明显的局限性，它们的效率仍然无法与病*载体相比。此外，在考虑在临床试验中使用这些方法时，还应解决其他问题，包括体内性能差、生理环境不稳定和细胞摄取障碍。
图6.来自于HIV-1慢病*载体的进化历程
LV生产的上游工艺瞬时和稳定转染
为了产生足够数量的基因工程化T细胞用于临床实验，生产大量的慢病*是必要的。通常，慢病*通过瞬时转染HEK(T)细胞制得。值得注意的是，为了根据GMP生产LVs，生产中使用的细胞系应符合细胞基质指南（如CPMP/ICH//95指南）。使用磷酸钙、聚乙烯亚胺等阳离子试剂或脂质体(lipofectamineVR、fugeneVRfectaminVR)进行转染。尽管用磷酸钙和阳离子脂类进行小规模转染可以获得相当高的转染率，但这些方法要么难以规模化，要么成本非常昂贵。基于稳定包装细胞系的LVs的制造已经发展到临床应用。虽然慢病*的瞬时转染更快更有效，稳定转染的细胞系产生的LVs更适合临床应用。由于其整体安全性和可重复性，稳定的包装方法使大规模生产的时间和成本降低。不幸的是，由于gag、pol、rev和VSV-G的细胞*性和细胞抑制作用，这一策略变得很复杂。包括“tet-on”和“tet-off”在内的诱导表达系统已经被应用来克服这个问题，这些基因的表达分别通过在细胞培养基中添加或去除四环素来调节。
贴壁与悬浮培养
对于小规模研究用LVs,贴壁细胞制备就足够了。使用贴壁细胞系产生更大的病*剂量是有限的，因为需要一个表面面积很大的的细胞培养容器培养细胞。贴壁培养可以通过增加培养单元来达到增加培养面积。培养皿，T型烧瓶，多层系统（例如细胞工厂），滚轴瓶也是大规模生产的培养系统。这些培养方法，同时需要多个培养箱放置，这本身就需要很大的培养空间。Kutner等人观察到用于LV生产的细胞系在HYPERFlask中生长速度比传统培养方法快10倍左右，从而产生更高的单位面积的病*滴度。然而，与其他系统相比，在载体滴度方面没有发现明显的差异。
最近，一种基于中空纤维生物反应器的新技术被引入到贴壁细胞培养环境中，用于大规模的LVs生产。中空纤维生物反应器是一种全自动的封闭系统，它有成千上万的多孔毛细血管(中空纤维)，细胞在纤维周围的毛细血管外培养。这种生物反应器的局限性是需要建立多个并行系统才能实现大规模生产。
工业生产慢病*的另一种策略是让包装病*所需的宿主细胞从贴壁培养向适应悬浮培养驯化。悬浮培养具有在搅拌生物反应器等系统中大规模扩增产生lv的细胞的优点。与贴壁细胞培养相比，悬浮适应细胞可以在大体积，小空间的环境下生产LVs，因为它们可以在不需要粘附表面积的情况下进行高密度扩增。此外，悬浮培养的另一个优点是，可在无血清的情况下生产供临床使用的LVs，从而减少外来因素的潜在污染。
各种容器培养系统已被开发，以增加细胞生长在悬浮液，包括摇瓶，波袋，搅拌罐生物反应器，玻璃生物反应器，不锈钢生物反应器。另外，也有许多研究报道了成功使用生物反应器，驯化HEK悬浮培养产生高滴度的LVs。有趣的是，在悬浮培养法中，使用聚乙烯亚胺对HEKT细胞进行瞬时转染，用于LV的生产，在一次性生物反应器中进行了50L规模的生产。另一个系统是iCELLisVR纳米系统(Pall,NY)，它被用于在由聚酯微纤维大分子载体组成的固定床生物反应器中，通过瞬间转染贴壁的HEKT细胞来产生LVs。该系统可在灌注培养下进行，接近6L的培养系统中产生滴度高达2xTU/ml(转导单位)的LVs。iCELLis生物反应器通过减少接种量、降低培养pH值、测量细胞代谢来控制灌注率，从而优化LVs的生产。
感染复数
影响转导效率的一个关键参数是感染复数（MOI）,MOI指的是每个细胞感染的病*粒子个数，病*粒子滴度以感染单位(IU)/mL或TU/mL表示。LVs的感染能力随细胞类型的不同而不同，因此每种不同的细胞类型需要不同的MOI。理想情况下，MOI与感染细胞数量之间应呈线性关系。为了确定T细胞有效转导所需的最佳MOI，可以使用一个表达报告基因如绿色荧光蛋白的LV，测试一系列MOI(如MOI)。然而，当考虑到患者的特异性变化时，用于描述转导条件的MOI的优化就变得更加困难。
LVs生产的下游流程在LVs生产的下游过程中有三个不同的阶段:(i)捕获阶段，它消除污染物，包括添加的材料、血清蛋白和质粒DNA(在瞬时转染中)，以及来源于宿主细胞的成分，细胞碎片，宿主细胞蛋白，宿主细胞DNA片段，产生澄清的细胞粗培养物。ii)中间纯化阶段，通常伴有25-50U/mL核酸酶处理，在澄清的上清中添加核酸酶，进一步去除特定的细胞，病*或加工过程中产生的杂质（如蛋白、DNA、质粒残留和内*素）(iii)抛光阶段，这是在合适的配方缓冲液中去除痕量污染物和小杂质以获得GMP级产品的最后一步。
捕获
低速离心和微滤用于实验室和大规模捕获过程。尽管微滤的效率很高，然而随着时间的推移，细胞碎片堵塞微孔造成病*颗粒截留是制约微滤的最大屏障，限制了LV的回收率。因此，大多数已发表的研究都集中在深度过滤的使用上，深度过滤已被证明可以最大限度地减少过滤器堵塞和在澄清步骤中病*颗粒的损失。深度过滤通过一系列孔径减小的膜来实现，一般从0.8-0.45μm该方法用来澄清多种包膜（如LVs）,非包膜病*颗粒（腺病*），病*回收率达到90%。深度过滤的高效率是通过深度相关的尺寸分离和最先进的深度过滤膜的带电性质及其三维结构来实现的。另外，需要格外