脓*症是由感染引起的全身性炎症反应综合征。除了早期的高死亡率外，脓*症还可以引起脓*症相关性脑病（SAE），这会显着增加患者的死亡率，并在很大程度上影响脓*症幸存者的生活质量。随着抗生素和生命支持疗法的发展，近年来脓*症的死亡率一直在下降。但脓*症相关性脑病的发生率仍然很高。SAE的特征是伴随着脓*症的弥漫性脑功能障碍，但缺乏中枢神经系统感染的直接证据。据报道，严重的脓*症患者约有70％存在认知缺陷。临床SAE的治疗缺乏有效的治疗方法。有研究表明，炎症反应尤其是炎症小体的激活，对于SAE的发展至关重要。不同的炎症小体中，NLRP3的研究最为充分，但抑制NLRP3能否缓解SAE仍然不清楚。
丙酮酸是葡萄糖代谢的关键中间分子，在许多体内外器官系统损伤模型中都起着保护作用。但丙酮酸溶液稳定性差，限制了其在临床上的治疗应用。年，Sims等人发现了丙酮酸的稳定衍生物，称为丙酮酸乙酯（EP）。研究表明，丙酮酸乙酯（EP）对烧伤，休克，坏死性胰腺炎等病理状态都具有保护作用，其作用方式类似于丙酮酸。作者先前的研究发现一种名为丙酮酸乙酯（EP）的代谢产物衍生物，能够有效抑制NLRP3炎性体的活化。丙酮酸乙酯对盲肠结扎和穿刺（CLP）模型小鼠有保护作用。此项研究旨在探究丙酮酸乙酯是否能够减弱CLP模型诱发的脓*症脑病。
方法动物：使用了C57BL/6（野生型），Nlrp3-/-和Asc-/-雄性小鼠，8-10周，体重20-25g。
脓*症模型：盲肠结扎和穿刺。用10μg/kg盐酸赛拉嗪和μmg/kg盐酸氯胺酮麻醉小鼠，在下腹部做一1.5cm切口，暴露盲肠。用4-0丝线结扎50%的盲肠，用21号针自肠系膜向外进行穿刺。从肠系膜穿刺孔中挤出少量（小滴）粪便，以确保穿刺孔通畅，缝合伤口。给小鼠皮下注射预热的生理盐水（37℃，5ml每g体重），使小鼠从麻醉中恢复。假手术组小鼠进行剖腹手术，取出盲肠后进行假手术。
给药方式：鞘内注射，CLP术后30分钟在脊髓L5-L6注射5μl丙酮酸乙酯。
行为学测试：矿场试验（术后第12天），新物体识别试验（术后第13、14天），Morris水迷宫（术后第15天进行检测）。
使用免疫组织化学评估大脑病理改变。使用蛋白质印迹法测定了海马和小胶质细胞中NLRP3的激活。分别评估了野生型、Nlrp3-/-和Asc-/-小鼠亚致死CLP模型的认知功能、小胶质细胞激活和神经发生。使用生理盐水或丙酮酸乙酯处理的Nlrp3-/-和Asc-/-小鼠进行CLP手术。
统计分析使用GraphPadPrism软件（6.0版）进行统计分析，P0.05被认为具有统计学意义。方差分析（ANOVA）和post-hoc检验用于比较两组以上的数据。多个样本时计算样本的平均值和标准误。
结果1、丙酮酸乙酯减轻实验性脓*症导致的认知功能下降
为了确定丙酮酸乙酯是否可以改善脓*症小鼠的学习和记忆功能障碍，作者在小鼠恢复活动能力后进行了矿场实验（第12天）、新物体识别测试（第13天），和水迷宫测试（第15天）。结果发现CLP小鼠在NOR测试阶段的辨别指数约为0.5，表明CLP小鼠失去了对旧物体的记忆，无法辨别新物体。丙酮酸乙酯处理组和假手术组小鼠的辨别指数均超过0.6，明显高于CLP组。此外，与假手术组相比，CLP使小鼠在水迷宫训练和测试阶段都无法找到平台。EP治疗可显著改善CLP后的学习和记忆。因此，丙酮酸乙酯改善了实验性脓*症的认知能力下降。
2、丙酮酸乙酯减少脓*症小鼠的小胶质细胞活化并恢复新生神经元的形成
为了研究EP减轻脓*症认知功能障碍的机制，作者首先评估了小胶质细胞的激活，这是神经炎症最重要的标志之一。成年小鼠CLP后，CA1区中的小胶质细胞的激活显著增加，EP处理后，小胶质细胞的激活显着降低。据报道，齿状回的颗粒细胞层中神经发生减少是一系列脑病认知功能障碍的原因。为了验证EP是否在改善SAE的神经发生中起保护作用，作者使用免疫荧光检测了齿状回（DG）区新生神经元的标志物——Doublecortin（DCX），发现CLP后DG区DCX的水平显着降低，EP处理恢复了CLP后DCX的表达。这些结果表明，EP可能通过促进神经发生和抑制脓*症中的小胶质细胞活化而在SAE中起保护作用。
3、丙酮酸乙酯抑制CLP小鼠海马和小胶质细胞中NLRP3炎性小体的活化
为了研究EP对SAE中NLRP3炎性小体的影响，作者检测了CLP小鼠海马中NLRP3的水平。结果表明，CLP手术可提高海马中NLRP3表达水平，而EP可显着减少NLRP3的表达。此外，作者之前的研究表明EP可以抑制小鼠巨噬细胞中NLRP3炎性小体的活化。为了确定丙酮酸乙酯（EP）是否也抑制小鼠小胶质细胞中NLRP3炎性小体的活化，用尼日利亚菌素刺激LPS诱导的小鼠小胶质细胞，10μmM的EP可显著抑制pro-IL-1β的裂解（IL-1β前体）。此外，EP显著抑制了由尼日利亚菌素诱导、LPS刺激的小鼠小胶质细胞中ASC斑点的形成。这些结果表明，EP抑制小鼠海马和小胶质细胞中的NLRP3炎性小体活化。
4、丙酮酸乙酯处理通过抑制NLRP3炎性小体的激活来缓解SAE
上述实验结果丙酮酸乙酯在细胞水平上抑制NLRP3炎性小体的活化。因此，作者推测丙酮酸乙酯可能会抑制脓*症小鼠大脑中NLRP3炎性小体的活化。为了进一步证明EP通过抑制NLRP3炎性体发挥保护作用，在Nlrp3和Asc基因敲除小鼠上进行了进一步的实验。结果发现NLRP3/ASC缺陷小鼠没有发生认知障碍，并且EP处理没有附加的保护作用（图4）。此外，作者发现Nlrp3和Asc基因敲除小鼠的神经发生比野生型CLP小鼠更加活跃，小胶质细胞的激活野生型CLP小鼠少。这些结果表明，EP可以通过抑制NLRP3炎性小体的激活来抑制CLP小鼠小胶质细胞的激活并改善认知功能障碍。
5、鞘内注射丙酮酸乙酯改善了CLP手术诱导的SAE。
为了探究EP是直接影响中枢神经系统还是通过改善系统性败血症（继发效应）从而缓解SAE，作者通过鞘内注射EP来验证这一问题。CLP或假手术后，进行了NOR测试以评估小鼠的认知功能。结果发现，鞘内注射EP能够改善SAE。这表明EP至少部分对大脑具有直接作用以改善SAE。
结论结果表明，丙酮酸乙酯通过抑制NLRP3炎性体对SAE小鼠起保护作用。简评：
该研究通过一系列的实验证明代谢产物丙酮酸的衍生物丙酮酸乙酯能够显著地抑制中枢神经炎症，包括小胶质细胞激活、IL-1β的切割等，并且能够影响神经发生。代谢与炎症本就密不可分，代谢产物对炎症反应的调节是一个非常值得深入探究的领域。丙酮酸乙酯具体是怎样影响哪几类细胞的代谢从而影响神经炎症的？神经发生的改变是丙酮酸乙酯的直接作用吗？这些问题还有待进一步探究。
（审校：顾希垚）
（编辑：张一哲）
参考文献：
EthylpyruvateprotectsagainstsepsisassociatedencephalopathythroughinhibitingtheNLRP3inflammasome.
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇